Terapia epigénetica en Ascariasis

Contexto:

La quimioterapia de helmintos se basa en gran medida en praziquantel (PZQ). Aunque el PZQ es muy seguro y tolerable, no previene la reinfección y la resistencia emergente es una preocupación principal.

Estudios recientes han demostrado que la focalización de la maquinaria epigenética en helmintos puede resultar en alteraciones graves en el desarrollo del parásito, lo que conduce a la muerte. Esta nueva ruta para el descubrimiento de fármacos en helmintos se ha centrado en clases de deacetilasa de histona y acetiltransferasa de histona como objetivos de fármacos epigenéticos.

Tema: El potencial antischistosomal de GSK-J4, un inhibidor de la demetilasa H3K27: perspectivas del modelado molecular, transcriptómica y ensayos in vitro.

Método epigenómico tratado: Empleo con GSK-J4, un inhibidor de demetilasa de histona H3K27

¿Cómo se lo hizo?

La presente evaluación de la capacidad farmacológica potencial de 14 enzimas desmetilasa de S. mansoni anotadas identificó al ortólogo de S. mansoni de KDM6A / UTX humano (Smp_034000) como la diana farmacológica más adecuada.

La base de datos Target-Pathogen y los ensayos de acoplamiento molecular se utilizaron para priorizar la farmacológica de las demetilasas de histona de S. mansoni. El perfil de transcripción de Smp_03400 se volvió a analizar utilizando las bases de datos disponibles. El efecto del inhibidor de GSK-J4 en helminto y la motilidad/viabilidad/oviposición de gusanos adultos fue evaluado por ensayos in vitro. El análisis ultraestructural se realizó en gusanos adultos expuestos a GSK-J4 mediante el escaneo de microscopía electrónica, mientras que las estructuras internas y la integridad de la fibra muscular fueron investigados por microscopía confocal después de la mancha de carmín o faloidina de Langeron.

Resultados

Corto plazo:

El tratamiento con GSK-J4 produjo efectos sorprendentes sobre la motilidad y mortalidad de gusanos adultos, así como la oviposición del huevo, de una manera dependiente de la dosis y el tiempo.

La microscopía electrónica confocal y de barrido reveló la pérdida de características originales en las fibras musculares y alteraciones en el contacto célula-célula después del tratamiento con GSK-J4.

Mediano plazo

Permite la mejor comprensión de las vías de señalización que dan forma a las interacciones específicas del helminto con el tratamiento.

Largo plazo:

Permite el descubrimiento de drogas antihelmínticas.

Figura 1. Efectos in vitro de GSK-J4 sobre la motilidad y viabilidad de los gusanos adultos.

Figura 2. Cambios ultraestructurales en la estructura corporal de gusanos adultos expuestos durante 24 horas de 20 µM de GSK-J4.

Referencias:

Lobo-Silva J, Cabral F, Amaral M, Miyasato P, de Freitas R, Pereira A et al. The antischistosomal potential of GSK-J4, an H3K27 demethylase inhibitor: insights from molecular modeling, transcriptomics and in vitro assays. Parasites & Vectors [Internet]. 2020 [citado el 07 de marzo de 2021];13(1). Disponible en: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32178714/

 Técnicas de Edición de Ácidos Nucleicos en Ascariasis

Tipo de Edición: Ex Vivo - Germinal

Dirigido hacia: ARN dirigido a ADN gen unc-22, gen daf-16

Dirigido por: CRISPR/Cas 9

Órgano/células a tratar: Epitelio intestinal

Vía de administración: Microinyección gonadal

Resultados: 

Corto plazo: Introducción de mutaciones en los nemátodos para producir ineficacia en su patogénesis.

Mediano plazo: Permite la mejor comprensión de los genes y las vías de señalización que dan forma a las interacciones especificas del nemátodo parásito con su huésped.

Largo plazo: Para producir vacunas contra los helmintos.

Referencias:

Castelletto M, Gang S, Hallem E. Recent advances in functional genomics for parasitic nematodes of mammals. The Journal of Experimental Biology [Internet]. 2020 [citado el  28 de febrero de 2021];223(Suppl 1):jeb206482. Disponible en: https://jeb.biologists.org/content/223/Suppl_1/jeb206482?utm_source=TrendMD&utm_medium=cpc&utm_campaign=J_Exp_Biol_TrendMD_1#sec-6

 Stem Cells en Ascariasis

Tema: Organoides-nuevos modelos para interacciones entre huésped-helminto

Tipo de Stem Cell: iPSC

Método de obtención: Obtenida por reprogramación celular.

Células usada para la reprogramación celular fueron los fibroblastos además se implicaron el uso de  cócteles (Klf 4, Oct4, Sox 2, c-Myc) con el fin de convertirse en células epiteliales intestinales.

Vía de administración: Vía parenteral

Resultados

Corto plazo: 

Comprender las interacciones moleculares y celulares de los helmintos con su huésped.

Mediano plazo:

La composición multicelular de los organoides permite estudiar el papel de los diferentes tipos de células en la invasión y colonización del helminto, el daño del huésped y las respuestas.

Los organoides pueden generar a partir de células madre derivadas del paciente, permitiendo estudiar el impacto a largo plazo de las infecciones patógenas en las características histológicas y fenotipos fisiológicos.

Largo plazo:

Como nuevas vías importantes para el desarrollo de nuevas terapias y vacunas contra helmintos, para entender los efectos antiinflamatorios de las infecciones por helminto, y para el uso de helmintos o sus productos como terapias alternativas para tratar enfermedades inflamatorias.

Referencias:

Duque-Correa M, Maizels R, Grencis R, Berriman M. Organoids – New Models for Host–Helminth Interactions. Trends in Parasitology [Internet]. 2020 [citado el 21 de febrero de 2021];36(2):170-181. Disponible en: https://uceedu-my.sharepoint.com/:b:/g/personal/jmvillamarin_uce_edu_ec/EasjM1eT5VpCg8P12M00Re0BRyHa0SsaFfYRTslIgvZNRw?e=FzwMEY

Animal transgénico para Ascariasis

Tema: Células T reguladoras en la infección por helmintos: inducción, función y potencial terapéutico. (1)

Tipo de animal transgénico: Ratones Knock- In (1)

Método por el que se obtuvo: Microinyección pronuclear (1)

Uso que se les ha dado: Simular enfermedad humana para comprender el proceso fisiopatológico y posible tratamiento. (1)

Explicación a detalle del uso:

Un papel clave son las células T reguladoras, estas células permiten que el parásito no solo sobreviva durante más tiempo en el humano, sino que también proteja al huésped de una respuesta inmune potencialmente patógena, significa que el helminto dentro del huésped puede desempeñar un papel importante en la regulación de los trastornos inmunológicos en los seres humanos. (1)

Con esta evidencia se apoya un papel central para Tregs inducido por parásitos en la regulación inmune por helmintos, esto permite comprender los mecanismos por lo que se produce esta inducción lo que puede proporcionar conocimientos esenciales para las vacunas y tratamientos farmacológicos. (1)

Ventajas y desventajas de los transgénicos

Ventajas

1. Permite simular enfermedades humanas y comprender el proceso fisiopatológico. (2)

2. Permite el desarrollo de tratamiento como vacunas, fármacos para enfermedades. (2)

3. Permite transformar a los animales en fábricas para la producción de proteínas de interés terapéutico e industrial. Las ovejas y cerdos ya modificados genéticamente están produciendo productos como la insulina y los factores de coagulación. (2)

4. Los animales están siendo considerados como donantes potenciales de órganos para pacientes con trasplante de órganos humanos. (2)

5. Mejorar la calidad de producción. La producción de animales y plantas resistentes a enfermedades y plagas económicamente devastadoras da el paso de ahorro de millones de dólares por parte de la industria ganadera y agrícola.(2)

Desventajas

1.El sufrimiento animal por parte de estos ensayos clínicos. (2)

2.Atenta en contra de la identidad genética de una especie, y esto supone grandes problemas éticos y morales. (2)

3. Otra área de preocupación es el límite construido entre lo que se considera "natural" y "antinatural". Para muchas personas, el cruce de especies es "antinatural", esto se vuelve especialmente problemático. (2)

4. Daños irreversibles e imprevisibles a plantas y animales tratados.(3)

5. El uso de alimentos transgénicos ha dado lugar a problemas de salud que han incluido la alergenicidad, los trastornos gastrointestinales y la carcinogenicidad. (3)

Referencias:

1. White M, McManus C, Maizels R. Regulatory T‐cells in helminth infection: induction, function and therapeutic potential. Immunology [Internet]. 2020 [citado 14 de febrero de 2021];160(3):248-260. Disponible en: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/imm.13190

2. Uzoeto O, Eruka N, Malachi J, Ezema T, Onele D, Okechukwu M et al. THE USE OF TRANSGENIC ANIMALS IN CLINICAL RESEARCH; THE PROS AND CONS (REVIEW). Pharmacologyonline [Internet]. 2019 [citado el 14 de febrero de 2021];2. Disponible en: https://uceedu-my.sharepoint.com/:b:/g/personal/jmvillamarin_uce_edu_ec/Efgnv7p8BilCglHgOExYSvQBe6Ih1Z2fejGrYJb_wkf-6g?e=7TJbtP

3. Pjesivac I, Hayslett MA, Binford MT.To Eat or Not to Eat: Framing of GMOs in American Media and Its Effects on Attitudes and Behaviors. Science Communication. [Internet]. 2020 [citado el 14 de febrero de 2021];42(6):747-775. Disponible en: https://sci-hub.se/https://doi.org/10.1177/1075547020947743

ADN recombinante artificial en la Ascariasis 

T: As16 recombinante expresado por levadura protege a los ratones contra la infección por Ascaris suum a través de la inducción de una respuesta inmune sesgada por Th2

O: Elaborar una vacuna antihelmíntica dirigida a las infecciones de Ascaris a través las proteínas As16 y As14 recombinantes.

G: Secuencia de As16(15,4 kDa) y As14(14,8 kDa)

ER: XhoI y AyrII

EL: Ligasa T4

V: pPICZ-A

CR: E.coli DH5a.

MTG: Transformación

MIC: Cultivo, Western blot, ELISA

Recombinación de ácidos nucleicos en la naturaleza

El ADN donador que no porta información necesaria para su propia replicación debe combinarse con el ADN del receptor a fin de establecerse en la cepa receptora. Por lo cual se describe a la conjugación bacteriana. La conjugación produce una transferencia unidireccional de ADN desde una célula donante hasta una célula receptora a través de llamado pilus sexual. El plásmido libre se desplaza de la célula donante a la receptora a través de un pilus sexual. El plásmido integrado favorece la transferencia de ADN genómico el cual se integra en el ADN de la célula receptora. (2)

Imagen obtenida por: Jawetz, Melnick y Adelberg. Microbiología médica. 25.ª ed. China: Mc Graw Hill; 2010. 

Referencias:

1. Wei J, Versteeg L, Liu Z, Keegan B, Gazzinelli-Guimaraes A, Fujiwara R et al. Yeast-expressed recombinant As16 protects mice against Ascaris suum infection through induction of a Th2-skewed immune response. PLOS Neglected Tropical Diseases [Internet]. 2017 [citado el 07 de febrero de 2021]; 11(7):e0005769. Disponible en: https://journals.plos.org/plosntds/article?id=10.1371/journal.pntd.0005769

2. Virolle C, Goldlust K, Djermoun S, Bigot S, Lesterlin C. Plasmid Transfer by Conjugation in Gram-Negative Bacteria: From the Cellular to the Community Level. Genes [Internet]. 2020 [citado el 07 de febrero de 2021];11(11):1239. Disponible en: https://www.mdpi.com/2073-4425/11/11/1239/htm

Técnica de secuenciación para Ascariasis

Se empleó la secuenciación para investigar la diversidad genética y la estructura genética de la población de especímenes de Ascaris de humanos y cerdos a través del gen de la COX-1 mitocondrial. Obteniendo bibliotecas de genoma de extremo emparejado: sesenta y ocho muestras de ADN de A. lumbricoides se secuenciaron utilizando la secuenciación de extremo emparejado de lectura corta De Illumina HiSeq 2500. El ADN fue cuantificado por UV Spec y Picogreen. Se utilizó un 100 ng de ADN basado en la cuantificación picogreen como plantilla para la preparación de la biblioteca NGS utilizando el kit de preparación de la biblioteca de muestras de ADN TruSeq Nano sin modificaciones. Los primeros dimers en las bibliotecas fueron eliminados por purificación adicional de cuentas AMPure. La secuenciación se realizó para obtener una profundidad genómica mínima de cobertura 20X para cada muestra. 

Como resultado se da que A. suum y A. lumbricoides forman un complejo genético que es capaz de entrecruzarse, formando un híbrido de la especie, con este conocimiento se puede utilizar para diseñar estrategias de control de Ascaris.

Figura 1: Filogenética de Ascaris spp basada en secuencias mitocondriales.

Figura 2: Diversidad genética de los especímenes de Ascaris.

Referencias:

Easton A, Gao S, Lawton S, Bennuru S, Khan A, Dahlstrom E et al. Molecular evidence of hybridization between pig and human Ascaris indicates an interbred species complex infecting humans. eLife [Internet]. 2020 [citado el 31 de enero del 2021];9. Disponible en: https://elifesciences.org/articles/61562#abstract

Prueba PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) para Ascariasis

Los ensayos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para parásitos intestinales se utilizan cada vez más en muestras de ADN fecal para mejorar la especificidad y sensibilidad de la detección, por eso se ha desarrollado técnicas basadas en el PCR en tiempo real (multiplex) para la identificación conjunta de helmintos y protozoarios en muestras de heces provenientes de personas con síntomas gastrointestinales, presentando una especificidad cercana al 100% y una sensibilidad del 80%, teniendo como gen blanco para Ascaris lumbricoides a la región interna transcrita 1 del ADN ribosomal (rDNA), por medio de tecnología Taqman 1 con sondas marcadas.

Referencias:

Reyes Chacón J. Evaluación del RT-PCR en el diagnóstico de 6 parásitos intestinales en un área con parasitismo de baja intensidad en el Trópico, [Internet]. Repositorio.usfq.edu.ec. [citado el 24 de enero de 2021]. Disponible en: https://uceedu-my.sharepoint.com/:b:/g/personal/jmvillamarin_uce_edu_ec/EXL6p7jFxNpMvGnxsv2_OoQBmPkshiME58Sam7-ZwRp9FQ?e=aqF6kb

 

Alteraciones de la epigenómica en Ascariasis

La exposición a helmintos induce cambios epigenéticos en las células inmunitarias, ya que, la infección crónica por helmintos reprograma la diferenciación de células T específicamente cuando las células T ingenuas se diferencian en células Th2, el locus Th2 (cromosoma 5q31) sufre extensas modificaciones epigenéticas que conducen a una configuración de cromatina preparada, haciendo que la cromatina sea accesible y promoviendo la expresión IL-4, IL-5 e IL-13,  todo esto ocurre por cambios de acetilación de histona, histona 3 (H3Ac) e histona 4 (H4Ac), mediante la adición de grupos de acetil a los residuos de lisina (K) en la cola N-terminal de histonas.

 

Figura 1. Correlación de los niveles H3Ac (A) y H4Ac (B) en seis promotores de genes con la edad, la carga total de óvulos y los niveles totales y específicos de IgE con Ascaris.

Referencia:

Zaksuki J, Acevedo N, Harb H, Erick L, Renks H, Ptazek D et al. IgE Levels to Ascaris and House Dust Mite Allergens Are Associated With Increased Histone Acetylation at Key Type-2 Immune Genes. Frontiers in Immunology [Internet].2020 [citado el 17 de enero de 2021]. Disponible en: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2020.00756/full

 Alteraciones de la traducción en Ascariasis

Las personas se infectan después de ingerir los huevos, las larvas nacen en el duodeno, pero recorren un trayecto hasta madurar en el intestino en su forma adulta, uno de esos espacios es en los pulmones, donde las larvas inducen una neumonía eosinofílica, aquí se produce una liberación de proteínas granulares como la proteína básica mayor tipo 1 y tipo 2 (MBP1 y MBP2), dañinas para los helmintos, ya que, ejerce en la interrupción de la membrana celular y actividad enzimática y la proteína catiónica de eosinófilo (EPC) que induce una exfoliación y lesión de células epiteliales.

Referencias:

Torres A, Vázquez E, Escudero E, Martínez J, Gómez J, Hernández M. Parasitosis con manifestaciones clínicas respiratorias. Medicine-Programa de Formación Médica Continuada Acreditado. [Internet] 2018 [citado el 10 de enero de 2021]; 12(58):3395-3402. Disponible en: https://sci-hub.se/https://doi.org/10.1016/j.med.2018.06.001

 

Alteraciones de la transcripción en Ascariasis

La ascariasis es causada por la ingestión de huevos infecciosos que contienen larvas L3 de alimentos y agua contaminados. Al contacto de la larva de estadio 3 con las células epiteliales intestinales, se encontró alteraciones en transcripciones de quimiocina (CCL5, IL8 y CXCL18), la quitinasa 3 como  proteína 1, y los genes de las citoquinas para IL17D para ser suprimido, directamente el parásito suprimió la liberación de estos genes implicados en respuestas inflamatorias y respuestas quimiotácticas, por tal motivo se presenta una respuesta baja de las células ante este invasor. A través de este mecanismo, el parásito aprovecha con sus enzimas proteolíticas (proteasa aspártica 6) a la fácil invasión de la barrera epitelial.

Referencia:

Ebner, F. Kuhring, M. Radonić, A. Midha, A. Renard, B. and Hartmann, S. Silent Witness: Dual-Species Transcriptomics Reveals Epithelial Immunological Quiescence to Helminth Larval Encounter and Fostered Larval Development. Frontiers in Immunology [Internet]. 2018 [citado el 03 de enero de 2020]; 9. Disponible en: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2018.01868/full

 Alteraciones genómicas en Ascariasis

Se reconoce que la genética del huésped es un determinante importante en la intensidad de la infección y de la morbilidad, por este motivo se ha vinculado al cromosoma 13 y su gen TNFSF13B como susceptible de Ascariasis. Este gen codifica para el factor de activación de células B (BAFF) implicado en la regulación de la activación, maduración y secreción de inmunoglobulina.

Además, se han detectado asociaciones significativas con la susceptibilidad de Ascariasis para los genes STAT6, IFN, IL-13 ADRB2 e IL-1045, y recientemente TGF-55.

Referencia:

Bornacelly A. Genetic regulation of the antibody response to the parasite Ascaris spp [Internet]. 1.ª ed. Cartagena; 2017 [citado 27 diciembre 2020]. Disponible en: https://uceedu-my.sharepoint.com/:b:/g/personal/jmvillamarin_uce_edu_ec/EYop2gPJ7KtFiExy65hhagsB1thrQgT2erwemeBWYi0vLg?e=nIRuwb

¿Por qué es un problema mundial la ascariasis?

La ascariasis es una parasitosis intestinal de más alta prevalencia por afectar al 30% de la población. El causante es la Ascaris lumbricoides o lombriz intestinal. Su mecanismo de infección es fecal-oral con su forma infectante: la larva de segundo estadio en huevo. Su microhábitat es en el intestino delgado especialmente en el yeyuno.

Su mecanismo de daño es traumático tisular por su fase migratoria y fase intestinal, inflamatorio, congestivo; puede producir fibrosis, neumonitis, la mucosa intestinal exuda y produce moco, el parásito forma focos equimóticos, secuestra nutrientes y altera la digestión de proteínas.

    

Imagen obtenida por: 

Botero D. Parasitosis humanas. 5.ª ed. Colombia: Panamericana; 2012. 

Referencia: 

https://www.karger.com/Article/Pdf/489486

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